ProteOrange 染料可以在聚丙烯酰胺凝膠中電泳后快速、輕松地可視化蛋白質(zhì)。 ProteOrange 是一種二苯乙烯型熒光團(tuán)，含有兩性離子片段。在核酸、多糖和其他分子存在的情況下，蛋白質(zhì)/十二烷基硫酸鈉膠束 (SDS) 選擇性地結(jié)合染料。 ProteOrange 可有效對(duì)分子量為 6 kDa 及以上的蛋白質(zhì)進(jìn)行染色。在三個(gè)數(shù)量級(jí)覆蓋的濃度范圍內(nèi)，熒光信號(hào)與蛋白質(zhì)濃度呈線性關(guān)系。

ProteOrange 凝膠染色的靈敏度大約是考馬斯染色的十倍，但不如銀染色敏感。對(duì)于 ProteOrange，檢測(cè)限為每條帶 3 ng 蛋白質(zhì)（考馬斯的檢測(cè)限約為 30 ng，銀染的檢測(cè)限約為 0.5 ng）。然而，與銀染相比，ProteOrange 染色的方案要簡(jiǎn)單得多，因?yàn)樗恍枰礈欤膊恍枰獦?biāo)準(zhǔn) SDS-PAGE 的固定。實(shí)驗(yàn)流程需要 30-60 分鐘才能完成，包括在含有染料的 7.5% 乙酸水溶液中孵育凝膠，以及用 7.5% 乙酸短暫沖洗凝膠 30 秒。應(yīng)使用波長(zhǎng)為 312-365 nm 的透射儀進(jìn)行可視化。 ProteOrange 庫(kù)存溶液在室溫下避光保存。

協(xié)議

1. 確保染料原液不含沉淀物。如果不是這種情況，請(qǐng)將試劑在 70 °C 下保持幾分鐘，直至沉淀物全溶解，然后搖動(dòng)小瓶。

2. 準(zhǔn)備染料的工作溶液。準(zhǔn)備的量取決于凝膠塊的大小和托盤(pán)尺寸。例如，25 mL 的溶液足以制備 10 × 15 cm 的凝膠片。要制備此溶液，請(qǐng)將 1.88 mL 冰醋酸溶解在 23 mL 水中，制成 7.5% 乙酸，并添加 5 μl 5000x ProteOrange 溶液。攪拌均勻，避光保存不超過(guò)三小時(shí)。

3. 電泳結(jié)束后，將凝膠放入托盤(pán)中，加入染料工作液，避光孵育20-60分鐘（對(duì)于較薄的凝膠或較低百分比的凝膠，應(yīng)縮短時(shí)間；對(duì)于1 mm的凝膠，60分鐘最佳厚，15% 凝膠）。染料的工作溶液只能使用一次，因?yàn)橹貜?fù)使用會(huì)導(dǎo)致靈敏度降低。

4. 用 7.5% 乙酸溶液（不含染料）沖洗凝膠 30 秒。凝膠已準(zhǔn)備好進(jìn)行可視化。

5. 為了可視化，將凝膠放在透照儀上。

6. 要去除染料，請(qǐng)將凝膠在 0.1% Tween 20 溶液中孵育 10-12 小時(shí)，或用 7.5% 乙酸溶液反復(fù)清洗。

筆記

• 為了提高靈敏度，我們建議在 TGB 緩沖液中添加 0.05% SDS（相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn) 0.1%）進(jìn)行電泳。 SDS 濃度的這種變化不會(huì)影響蛋白質(zhì)的遷移率，但會(huì)縮短染色時(shí)間。

• 在含有甲醇/乙醇的溶液中染色之前不要固定凝膠。

• 對(duì)于小蛋白質(zhì)或低百分比凝膠，應(yīng)選 10% 乙酸溶液。

• 該染料不適用于將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上后對(duì)其進(jìn)行染色。

• 如果凝膠用于蛋白質(zhì)印跡，ProteOrange 染色可以在標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)運(yùn)緩沖液中進(jìn)行，但這會(huì)導(dǎo)致靈敏度下降。

• 對(duì)于 Triton X-100 凝膠電泳，電泳完成后立即在 Triton X100 不含 TGB 緩沖液中清洗凝膠（3×20 分鐘），然后不久將凝膠在添加了 0.05% SDS 的 TGB 緩沖液中孵育 30 分鐘，然后進(jìn)行染色。

• 為了在電泳過(guò)程中對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行染色，ProteOrange 應(yīng)溶解在上層（陰極）緩沖液中。電泳結(jié)束后，將凝膠在 7.5% 乙酸溶液中孵育 30 分鐘，以降低熒光背景水平。

• 無(wú)需 SDS 即可對(duì)凝膠進(jìn)行染色，但該方法的靈敏度會(huì)降低，并且靈敏度很大程度上取決于蛋白質(zhì)的氨基酸組成。除非電泳后應(yīng)回收天然蛋白質(zhì)，否則凝膠應(yīng)在含有 0.05% SDS 的緩沖液中孵育，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行染色。

• 通常，預(yù)染色的蛋白梯用 ProteOrange 進(jìn)一步染色時(shí)不會(huì)發(fā)出熒光。僅使用未染色的梯子。

• 用 ProteOrange、考馬斯染色或銀染色后仍然可以進(jìn)行。