神經(jīng)酰胺是鞘脂的前體，由鞘氨醇和脂肪酸通過(guò)酰胺鍵連接而成。 BDP 神經(jīng)酰胺是合成的熒光脂質(zhì)，是 BDP 熒光團(tuán)與鞘氨醇的綴合物。在細(xì)胞內(nèi)部，BDP 神經(jīng)酰胺融入高爾基體膜中，因此這些染色劑廣泛用于細(xì)胞生物學(xué)，通過(guò)熒光顯微鏡觀察活細(xì)胞和固定細(xì)胞中的高爾基體。

溶液的制備

1.1 庫(kù)存解決方案

BDP FL 神經(jīng)酰胺：

• 將 50 μg BDP FL 神經(jīng)酰胺溶解在 87.2 μL DMSO 中，以獲得 1 mM 儲(chǔ)備溶液。

• 將 250 μg BDP FL 神經(jīng)酰胺溶解在 436 μL DMSO 中，以獲得 1 mM 儲(chǔ)備溶液。

BDP TMR 神經(jīng)酰胺：

• 將 50 μg BDP TMR 神經(jīng)酰胺溶解在 73.6 μL DMSO 中，以獲得 1 mM 儲(chǔ)備溶液。

• 將 250 μg BDP TMR 神經(jīng)酰胺溶解在 368 μL DMSO 中，以獲得 1 mM 儲(chǔ)備溶液。

BDP TR 神經(jīng)酰胺：

• 將 50 μg BDP TR 神經(jīng)酰胺溶解在 70.8 μL DMSO 中，以獲得 1 mM 儲(chǔ)備溶液。

• 將 250 μg BDP TR 神經(jīng)酰胺溶解在 354 μL DMSO 中，以獲得 1 mM 儲(chǔ)備溶液。

將儲(chǔ)備溶液儲(chǔ)存在-20°C或-80°C避光條件下。避免反復(fù)凍融循環(huán)。

1.2 染色液

1. 將 10 mL 的 Hanks 緩沖鹽溶液與 10 mM HEPES (HBSS/HEPES)、pH 7.4 測(cè)量到 50 mL 塑料管中。其他無(wú)血清平衡鹽溶液，例如 PBS，也適用于此目的。

（可選）將 1 mM Ca 2+和 0.5 mM Mg 2+添加到緩沖溶液中，以防止活細(xì)胞聚集并從玻璃上分離。

2. 在裝有緩沖液的試管中添加 3.4 mg (0.34 mg/mL) 脫脂 BSA。

3. 添加 200 µL 1 mM 神經(jīng)酰胺庫(kù)存溶液，以獲得 5 µM 神經(jīng)酰胺/5 µM BSA 工作溶液。神經(jīng)酰胺的稀釋取決于細(xì)胞類(lèi)型和密度，應(yīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定。

所得神經(jīng)酰胺/BSA復(fù)合物溶液可在-20°C下儲(chǔ)存在塑料瓶中。

細(xì)胞染色

2.1 活細(xì)胞

1. 在無(wú)菌蓋玻片上培養(yǎng)細(xì)胞。貼壁細(xì)胞可以直接在蓋玻片上染色。

2. 從蓋玻片中吸出介質(zhì)。

3. 用適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)（例如 HBSS/HEPES）沖洗細(xì)胞。

4. 將細(xì)胞與 5 µM 神經(jīng)酰胺/BSA 溶液在 4°C 下孵育 30 分鐘。

5. 用冰冷的培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞幾次。

6. 用脫脂 BSA (0.34 mg/ml) 的 HBSS/HEPES 溶液在室溫下沖洗細(xì)胞四次，持續(xù) 30 分鐘。

7. 將細(xì)胞在新鮮培養(yǎng)基中于 37°C 進(jìn)一步孵育 30 分鐘。

8. 用新鮮培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞。

9. （可選）染色細(xì)胞可在 4% 甲醛中于 4 °C 固定 2 分鐘。在 PBS 中清洗固定細(xì)胞兩次。

10. 對(duì)于熒光顯微鏡，將帶有染色細(xì)胞的蓋玻片翻轉(zhuǎn)到載玻片上，將它們放置在載玻片和蓋玻片之間。

2.2 固定單元格

1. 4°C 下將細(xì)胞固定在 4% 甲醛中 5 分鐘。

2. 固定細(xì)胞用 PBS 清洗兩次，每次 5 分鐘。

3. 將細(xì)胞與 PBS 中的 5 µM 神經(jīng)酰胺/BSA 在 4°C 下孵育 30 分鐘。

4. 用脫脂 BSA (0.34 mg/ml) 的 PBS 溶液在室溫下沖洗細(xì)胞四次，持續(xù) 30 分鐘。

5. 在 PBS 中沖洗細(xì)胞兩次。

6. 對(duì)于熒光顯微鏡，使用封固劑將細(xì)胞封固在蓋玻片下 。