常見細(xì)胞污染

細(xì)胞污染——培養(yǎng)物出現(xiàn)渾濁、混濁。培養(yǎng)液pH值升高，液黃。細(xì)胞異常的形態(tài)，如胞質(zhì)內(nèi)細(xì)菌吞噬體。細(xì)胞的生長速率減緩，對數(shù)生長期變得不規(guī)律。異常的細(xì)胞死亡或細(xì)胞溶解情況。

真菌污染——培養(yǎng)液可能出現(xiàn)異味。培養(yǎng)皿內(nèi)有異常的顏色、紋理或斑點。細(xì)胞顯示出不正常的細(xì)胞形態(tài)，如真菌吞噬體或真菌絲狀體。細(xì)胞的生長速率可能受到抑制，細(xì)胞數(shù)量不斷減少。

支原體污染——支原體污染通常不會導(dǎo)致明顯的細(xì)胞培養(yǎng)液變化。因此，支原體污染通常需要PCR或DNA雜交來檢測。可能出現(xiàn)感染跡象，如出現(xiàn)包涵體或囊泡。細(xì)胞的生長速率減緩。

常見污染處理

因污染會改變細(xì)胞表型，在細(xì)胞種子充足及排除污染因素的情況下，首先丟棄污染細(xì)胞，重新復(fù)蘇。

在未檢測的情況下沿用當(dāng)前細(xì)胞試劑及耗材可能導(dǎo)致污染擴(kuò)散，應(yīng)及時滅菌或丟棄。

如果懷疑細(xì)胞培養(yǎng)受到污染，應(yīng)立即采取行動來確認(rèn)并解決問題。常見的處理方法包括：

1.隔離：將受污染的培養(yǎng)物隔離，并最后處理污染細(xì)胞，以防止污染蔓延到其他培養(yǎng)物中。

2.污染源排除：查找和消除污染的來源，可使用無抗LB搖菌培養(yǎng)或污染檢測試劑。

3.更換培養(yǎng)液：將受污染的培養(yǎng)液更換為新的培養(yǎng)液，細(xì)菌污染添加敏感抗生素如氨芐青霉素，真菌添加兩性霉素B，支原體添加氧氟沙星以控制污染。

4.細(xì)胞重新傳代：如有必要，將細(xì)胞重新傳代到新的培養(yǎng)皿中，離心速度低于平時，200-300g。

5.污染檢測：進(jìn)行污染檢測，以確認(rèn)污染的類型和程度，從而采取適當(dāng)?shù)拇胧?/span>

操作手冊

● 原代細(xì)胞提取

● 血清更換注意事項及步驟

● 血清儲存及化凍

● 持續(xù)更新中

原代細(xì)胞提取-1

固體組織樣品（肝，肺，腫瘤等）

1.分離組織后立即移入超凈臺操作（＜20min)，或放入組織保存液中四度保存（不超過48h)。

注意：以下步驟均需無菌操作，且保持低溫！

2.取一無菌小皿，加入3ml預(yù)冷的PBS，放入組織清洗。重復(fù)此步驟一次。

3.用無菌剪和無菌鑷（高溫高壓滅菌）去除脂肪或壞死區(qū)域等非目標(biāo)組織。

4.轉(zhuǎn)移組織塊至一無菌15ml/50ml離心管中，加入組織體積10倍的advanced DMEM/F12培養(yǎng)基（緩沖液可自行調(diào)整，與后續(xù)培養(yǎng)體系一致）。離心管置于冰上，用無菌剪將組織剪成肉泥狀。（此步驟注意低溫）

5.四度600g離心5分鐘，去上清，加入消化液（浸沒組織），37℃搖床（800rpm)消化15min，視解離狀態(tài)調(diào)整消化時間，一般不超過45min。（消化液需視組織類型自行調(diào)整。一般組成為膠原酶1和4，濃度為400-1000U/ml，以及核酸酶5-20U/ml，可選擇添加10uM ROCK抑制劑以提高組織活率。）

原代細(xì)胞提取-2

6.消化結(jié)束立即冰上，加入體積6%的血清終止消化，四度離心棄上清，用巴氏管吸取1-2ml全培養(yǎng)基重懸后細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，根據(jù)后續(xù)目的和細(xì)胞類型選擇濾網(wǎng)大小（類器官需要細(xì)胞團(tuán)一般選擇較大的100um，建庫的單細(xì)胞懸液一般選擇70um或更小）。

7.視上一步沉淀顏色選擇是否裂紅，裂紅至沉淀無明顯紅色即可。裂紅液現(xiàn)配，至少10ml，常溫避光裂紅10min。

8.用巴氏管充分混勻細(xì)胞懸液，吸取10ul細(xì)胞懸液與2x臺盼藍(lán)混勻后計數(shù)板計數(shù)。一般細(xì)胞活性＞85%為達(dá)標(biāo)。如不達(dá)標(biāo)，則低速(200-300g)四度離心后棄上清，重懸，再次計數(shù)和測量活性，直至達(dá)標(biāo)。）

9.計算所需細(xì)胞數(shù)量并進(jìn)行下一步操作，直接種板培養(yǎng)，點膠，或上機(jī)等。

液體樣品（血液，胸水，腹水等）

1.直接600g四度離心5min后棄上清，用medium重懸清洗兩次。

2.過濾可選，直接進(jìn)入裂紅判斷步驟

3.后續(xù)步驟同上。