熒光壽命的測(cè)定

吸收光后，分子在釋放吸收的能量之前保持一定時(shí)間的電子激發(fā)態(tài)。在這里，不同的光化學(xué)過(guò)程以不同的概率相互競(jìng)爭(zhēng)。除了無(wú)輻射失活外，還可以發(fā)射光，例如以熒光的形式。
之后激發(fā)分子數(shù)（n1）已降至1/e的系數(shù)（約37%），稱(chēng)為熒光壽命（τ佛羅里達(dá)州):

n1（t） = n1（0） e（- t / τ佛羅里達(dá)州)

有機(jī)染料的衰減行為可以用來(lái)識(shí)別它。然而，熒光壽命(熒光衰減時(shí)間)不是一個(gè)固定的量，而是受染料所處環(huán)境即溶劑和溫度的影響。

ATTO染料 的熒光壽命通常在納秒范圍內(nèi)（10 -9秒）。對(duì)于我們的目錄，使用下述“時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)"方法確定 22 °C 水溶液（PBS，pH 7.4）中羧基衍生物的值。為此使用了來(lái)自HORIBA Jobin Yvon的使用壽命測(cè)量設(shè)備TemPro 。


時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù) （TCSPC）
激發(fā)后熒光光子的發(fā)射是一個(gè)統(tǒng)計(jì)過(guò)程。因此，單個(gè)分子保持激發(fā)態(tài)的持續(xù)時(shí)間也是一個(gè)統(tǒng)計(jì)量。然而，如果我們觀(guān)察許多相同分子的集合，我們會(huì)得到一個(gè)定義明確的衰變統(tǒng)計(jì)量。
在當(dāng)今常用的熒光壽命測(cè)量方法TCSPC方法中，這些統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)的時(shí)間分辨非常好 - 低至皮秒范圍（10-12 s） – 并以高檢測(cè)靈敏度進(jìn)行測(cè)量。為此，用周期性的極短光脈沖照射樣品。激發(fā)后，樣品發(fā)射熒光光子。測(cè)量第一個(gè)光子到達(dá)探測(cè)器之前的確切時(shí)間量。這些單個(gè)事件被計(jì)數(shù)，即作為“計(jì)數(shù)"輸入直方圖。隨著這種單個(gè)實(shí)驗(yàn)的非常頻繁的重復(fù)，最終通過(guò)加計(jì)數(shù)來(lái)獲得樣品衰變曲線(xiàn)的指數(shù)過(guò)程。

在每個(gè)激光脈沖和計(jì)數(shù)過(guò)程之后，必須重置測(cè)量電子設(shè)備。在此死區(qū)時(shí)間內(nèi)無(wú)法記錄任何光子。因此，以每 100 個(gè)激發(fā)脈沖僅檢測(cè)到約 1 個(gè)光子的方式選擇條件。否則，在較高的速率下，直方圖中的短時(shí)間會(huì)被高估并且衰減曲線(xiàn)會(huì)扭曲（“堆積"）。實(shí)際上，測(cè)量通常以所謂的“時(shí)間反轉(zhuǎn)"模式進(jìn)行，即熒光光子開(kāi)始時(shí)間測(cè)量，而由另一個(gè)二極管記錄的激光脈沖停止時(shí)間測(cè)量。

在測(cè)量染料樣品之前，應(yīng)提供有關(guān)染料的以下信息：

• 吸收和熒光最大值，例如來(lái)自溶液或文獻(xiàn)值的吸收和熒光光譜的測(cè)量。

• 熒光衰減時(shí)間的近似數(shù)量級(jí)，例如根據(jù)以前的測(cè)量、可比系統(tǒng)的測(cè)量或文獻(xiàn)值估計(jì)。

光譜數(shù)據(jù)決定了激發(fā)光源的選擇——如今通常使用強(qiáng)激光或半導(dǎo)體二極管——以及用于發(fā)射光譜選擇的截止濾光片的選擇。應(yīng)選擇此濾光片以防止散射的激發(fā)光到達(dá)檢測(cè)器。

除了選擇合適的激發(fā)光源和合適的邊緣濾光片外，還必須遵守其他實(shí)驗(yàn)要求：

• 樣品溶液在激發(fā)波長(zhǎng)及以上的1cm比色皿中的吸光度應(yīng)<0.1，以避免重吸收。例如，稀釋溶液還可以防止由聚集和濃度缺失引起的問(wèn)題。

• 散射樣品溶液會(huì)導(dǎo)致評(píng)估期間意外縮短壽命的“出現(xiàn)"。例如，可以通過(guò)μ過(guò)濾樣品溶液來(lái)避免這種情況。

• 通常，透明液體在 1 厘米熒光比色皿中以 90° 排列的方式測(cè)量。

• 檢測(cè)時(shí)間窗口應(yīng)足夠長(zhǎng)（至少 10000 個(gè)計(jì)數(shù)）。

在根據(jù)TCSPC原理進(jìn)行熒光壽命測(cè)量的情況下，還需要確保計(jì)數(shù)率不超過(guò)脈沖激發(fā)光源重復(fù)率的2%。如上所述，這避免了所謂的“堆積"。

為了降低計(jì)數(shù)率，

• 稀釋供試品溶液。

• 中性玻璃濾光片可以插入激發(fā)通道，從而降低激發(fā)光的強(qiáng)度。

• 可以將波長(zhǎng)較長(zhǎng)的邊緣濾光片插入發(fā)射通道，從而減小檢測(cè)到的熒光的光譜范圍。

要將計(jì)數(shù)率提高到 2%，可以應(yīng)用反向度量。

在測(cè)量熒光衰減時(shí)間時(shí)，還應(yīng)測(cè)量散射溶液.dem例如0.01%Ludox AS40膠體二氧化硅溶液，以確定儀器功能，即電子器件的響應(yīng)。這種參考測(cè)量的結(jié)果可以在以后的數(shù)據(jù)評(píng)估中考慮在內(nèi)。

通過(guò)提供的軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。在這里，測(cè)量的數(shù)據(jù)點(diǎn)由曲線(xiàn)擬合。熒光衰變曲線(xiàn)的理論過(guò)程與放射性衰變一樣，對(duì)應(yīng)于一階反應(yīng)，因此是單指數(shù)的。但是，它也可能導(dǎo)致更高的指數(shù)曲線(xiàn)，以便更好地?cái)M合測(cè)量點(diǎn)。例如，在一個(gè)溶液中存在具有不同熒光壽命的不同物種時(shí)，可能就是這種情況。

下圖說(shuō)明了一批 阿托 488 卡波西與 天寶裝置。可以識(shí)別上述參數(shù)，例如檢測(cè)時(shí)間窗口（峰計(jì)數(shù)>10000），使用Ludox溶液的參考測(cè)量/提示以及樣品的測(cè)量。CHISQ = 1.1 且標(biāo)準(zhǔn)差均勻分布的雙指數(shù)評(píng)估結(jié)果證明是最佳擬合的。熒光衰減時(shí)間 阿托 488 22 °C 水溶液 （PBS， pH 7.4） 中的羧基為 4.1 ns，該樣品中的相對(duì)比例為 96.78 %。



軟件中選擇的補(bǔ)償曲線(xiàn)的質(zhì)量以及確定的熒光壽命的正確性等由參數(shù)χ2 （CHISQ，XSQ）和加權(quán)殘差。
良好的契合度可以通過(guò)以下方式識(shí)別：

• χ 2 < 1.2 并且在添加另一個(gè)組件時(shí)沒(méi)有顯著變化（單指數(shù) -> 雙指數(shù)等）

• 加權(quán)殘差的均勻分布，標(biāo)準(zhǔn)差

• 與以前的測(cè)量值或文獻(xiàn)值一致

商業(yè)設(shè)備的供應(yīng)商提供大量的手冊(cè)和產(chǎn)品文檔，通常詳細(xì)描述相關(guān)設(shè)備的正確操作和所提供的軟件。通過(guò)遵守給出的說(shuō)明，例如，測(cè)量具有已知熒光衰減時(shí)間的染料，您將擁有必要的常規(guī)和經(jīng)驗(yàn)來(lái)測(cè)量所用設(shè)備的“正確"壽命